涂片及染色的知識

涂片及染色是微生物學的基本技術，也是觀察細菌zui簡單且行之有效的方法。通常情況下，由于細菌個體較小，較透明或半透明，如未經染色往往不易觀察識別。因此借助于染色法可使細菌著色，與視野背景形成鮮明對比，從而易于在顯微鏡下進行觀察。

注意事項：

(1)載玻片要清潔無油污，否則菌液不易涂開。涂片時取培養物宜少，培養物涂層宜薄，涂層過厚則不易觀察細菌形態。

(2)干燥和固定時，玻片不能直接在離火焰很近的位置上烘烤，否則會破壞細菌形態并使之變形，影響觀察結果。

(3)觀察時如需用到油鏡，油鏡檢查前玻片應*干燥，觀察后要將油鏡用擦鏡紙等*擦拭干凈。


簡單染色法即只用一種染料對涂片進行染色，該法簡便易行，適用于菌體的一般形態觀察。通常情況下由于細菌菌體多帶負電荷，易和帶正電荷的堿性染料結合而被染色，因此常用堿性染料進行簡單染色，如美藍、堿性復紅、結晶紫、孔雀綠、番紅等。所有的苯胺染料，均可用來做簡單染色法的染色劑。在進行染色之前的制片過程是影響染色結果好壞的關鍵性步驟。



制備細菌染色片一般要經過涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟(見下圖),然后用顯微鏡，甚至油鏡觀察。




(一)涂片

取一干凈的載玻片，滴加一小滴蒸餾水于載玻片中央。按無菌操作要求，接種環經灼燒滅菌，待冷卻后用接種環從菌種試管斜面上(培養皿表面)挑取少量培養物(不要挑破培養基),置于載玻片上的水滴中，與水混合并輕輕涂布成直徑約1cm左右的均勻薄層。操作完成后，接種環要再經灼燒滅菌，放歸原處。



(二)干燥

將涂片于室溫中自然干燥或者置于酒精燈火焰高處，微熱烘干。切記不能直接在火焰上烘烤，以免菌體烤焦變形，影響對菌體的觀察。



(三) 固定

涂片標本面向上，快速通過酒精燈火焰外焰2次~3次，進行標本固定。固定的目的在于殺死細菌以固定其細胞結構；保證菌體牢固地粘附在載玻片上，染色或水洗時不至于脫落；同時改變菌體對染料的通透性，有利于著色，增強染色效果。固定時，以載玻片背面加熱處觸及皮膚而不覺過燙為宜(一般不超過60 ℃ )。



(四)染色

標本玻片水平放置，滴加1滴~2滴染色液，使染色液*覆蓋涂片區域，染色時間視不同標本和染料的性質而定。



(五)水洗

染色到一定時間后，傾去染液，斜置玻片， 自玻片上端用自來水沖洗至流下的水無色為止；或將玻片置于玻片架上，用洗瓶傾注水流進行水洗。注意沖洗水流不宜過急、過大，同時要避免直接沖在涂片處，導致涂片受損。



(六)干燥、鏡檢

自然晾干，或用吸水紙吸去玻片上的多余水分后再晾干，但要注意勿將菌體抹掉。*干燥后，用顯微鏡甚至油鏡檢查。