免疫組化實驗中如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色?

1、非特異性染色產生原因及其解決方案：

(1)游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置時用透析法或層析法分離熒光素標記的二抗和游離的二抗。購買高質量、高純度的熒光素二抗。

(2)抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。

(3)組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原(如Forssman氏抗原)，可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。延長血清封閉時間。

(4)從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

(5)抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。

(6)熒光素不純、標本固定不當等。

(7)一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調整一抗和二抗孵育條件和濃度至。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數和延長清洗時間。

2、陰性染色產生的原因有：

(1)一抗和二抗濃度不合適或孵育條件不妥。

(2)熒光素提前衰退。熒光素質量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。

(3)血清封閉時間過長。

(4)抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應。

(5)組織切片不平、裂片或脫片很嚴重，易引起大塊陰性著色。

(6)組織標本不新鮮或已經冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達的部位陰性染色或弱著色。

(7)熒光顯微鏡不會使用，激發波長選擇錯誤。

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