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一、RNA的提取(詳見RNA提取及反轉錄)

不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為Real-Time PCR對RNA樣品的質量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在總rna的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂;取2ug進行RNA的甲醛變性膠電泳檢測，如果存在DNA污染時，要用DNase I進行消化(因為在處理過程中RNA極易降解，建議體系中加入適量RNA酶抑制劑)。

二、DNAse I 消化樣品RNA 中的DNA

用DNase I 消化DNA

組份 加量

模板(RNA) 10ug

RNase Inhibitor 4ul

DNase I buffer 10ul

DNase I 10ul

DEPC處理H2O 至100ul

混勻，37℃ 90min

三、RNA瓊脂糖凝膠電泳

1.1%的瓊脂糖凝膠電泳凝膠的配制：

1) 稱取瓊脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS緩沖液和39.5ml的DEPC水，放微波爐里溶化。

2) 待冷卻到60攝氏度左右時，加入1ml甲醛，搖勻(避免產生氣泡)。倒入凝膠板上凝固30min。

2.取各個RNA樣品4µl，加入6×RNA電泳上樣緩沖液2µl混勻，加入變性膠加樣孔中。

3.120V電壓下電泳25min。用凝膠紫外分析儀觀察，照相保存。

4.RNA電泳結果如下圖所示。可見28S和18S兩條明亮條帶，無DNA條帶污染。

溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數擴增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。

如果在熒光背景信號階段出現很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態雜質;

如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。

如果引物二聚體存在則陰性對照會出現抬頭現象，這在Real-Time PCR中很難避免;

若是陰性對照的溶解曲線出現和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結果不可用。

在溶解曲線中出現雙峰有三種可能：

① 引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設計引物;

② 在做基因表達差異時容易出現DNA被擴增峰(只在引物跨內含子時存在)，出現原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA;

③ 擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設計并驗證引物。

九、表達差異的計算方法

定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數;相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本或是目標轉錄本在不同時相的表達差異之間的表達差異。

2-△△CT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。

在有些情況下，并不需要對轉錄本進行定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說X基因在經過某種處理后表達量增加2.5倍比說該基因的表達從1000 拷貝/細胞增加到2500拷貝/細胞更加直觀。

2-△△CT方法的推導(詳見實時定量PCR和2-△△CT法分析基因相對表達量)

補充：在DNase I 消化樣品RNA 中的DNA后，需要對樣品重新進行氯仿抽提，具體實驗流程如下：

消化后總體積10Oul，體積太少，不利于抽提，我們往往補加200ulDEPC水。

1. 向離心管中加入等體積氯仿(約300ul) ，劇烈顛倒，充分混勻至中層出現白色片狀沉淀。4℃14000 rpm離心8min，取上清(約250ul)。

2. 加入1/10體積的NaAC(3M)(約25ul)和預冷的等體積異丙醇(約280ul)，-20℃放置20min。

3. 4℃14000 rpm離心15min，去上清，注意不要觸到沉淀。

4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm離心3min，去上清。

5. 瞬時離心，用200ul(或10ul)的槍頭小心吸去離心管底的殘存液態(勿吸到管底的沉淀)。

6. 把離心管放置于超凈臺晾至約5-10 分鐘(勿*干燥，否則很難溶)。加入30~50μl的無RNase的水，靜止1min 后，振蕩30sec，瞬時離心。

7. 將提取的RNA立即進行下游實驗，或放-20℃保存。

PCR實驗代做，MRNA實驗代測的整個操作流程詳解